中性粒細胞胞外誘捕網在血栓形成中的作用及檢測技術進展

內容簡介：
中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）是中性粒細胞激活后釋放的以DNA和組蛋白為核心的網狀結構，其在天然免疫中扮演防御角色，但其過度形成與病理性血栓形成密切相關。本文聚焦于NETs在動脈粥樣硬化、深靜脈血栓及相關凝血病中的最新研究進展。重點介紹了針對NETs標志物（如瓜氨酸化組蛋白H3 Citrullinated Histone H3, Cit-H3）的特異性免疫熒光、免疫組化及ELISA檢測技術的原理與應用。文章詳細闡述了如何利用高特異性的抗Cit-H3（如Abcam抗體的克隆號RM913）等抗體，在組織切片和血漿樣本中精準識別并定量NETs，并討論了多種檢測技術聯用（如Sytox Green DNA染料與抗體共標記）在提升檢測特異性方面的策略，為研究血栓炎癥提供了關鍵方法學支持。

關鍵詞： 中性粒細胞胞外誘捕網（NETs）、瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）、免疫組織化學、血栓形成、免疫熒光

正文：

中性粒細胞是人體先天免疫系統的第一道防線，傳統上被認為主要通過吞噬作用、脫顆粒和產生活性氧來清除病原體。2004年，Brinkmann等人發現了一種全新的中性粒細胞抗菌機制——中性粒細胞胞外誘捕網（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）。NETs是由活化的中性粒細胞釋放的由染色質DNA纖維、組蛋白和大量顆粒蛋白（如中性粒細胞彈性蛋白酶NE、髓過氧化物酶MPO）組成的網狀結構，能夠有效捕獲并殺滅細菌、真菌和病毒。

NETs的形成（又稱NETosis）是一個活躍的細胞生物學過程，依賴于活性氧（ROS）的產生、肽基精氨酸脫亞胺酶4（PAD4）的激活以及后續的組蛋白瓜氨酸化。其中，組蛋白H3的精氨酸殘基在PAD4作用下轉化為瓜氨酸，即瓜氨酸化組蛋白H3（Citrullinated Histone H3, Cit-H3），是NETs形成的一個關鍵性生化事件和特異性標志物。

然而，正如一把，不受控制的NETs釋放也會對宿主組織造成嚴重損害。近年來，大量研究表明NETs在病理性血栓形成中扮演了至關重要的角色。在動脈粥樣硬化斑塊中，NETs成分可以促進血小板活化、聚集，并作為支架加速血栓的形成。在深靜脈血栓（DVT）模型中，NETs被證實是血栓結構的核心組成部分。特別是在重癥患者中，大量NETs的形成被認為是導致其高凝狀態和致命性微血栓的重要原因之一。

因此，準確檢測和定量組織及循環系統中的NETs，對于理解血栓性疾病的發病機制、開發新的生物標志物和治療靶點具有重大意義。由于NETs是復雜的混合體，其檢測需要多管齊下的策略，而基于抗體的免疫學檢測技術因其高特異性和靈敏度成為其中的。

1. 免疫熒光顯微鏡技術：
這是可視化NETs的“金標準"。通常采用共聚焦顯微鏡對細胞或組織切片進行多重熒光標記。

• DNA染料：如DAPI、Hoechst或細胞不透性的Sytox Green/Orange，用于顯示NETs的DNA骨架。

• 抗組蛋白抗體：如抗組蛋白H3抗體，用于標記DNA上的組蛋白核心。

• 抗特異性NETs標志物抗體：這是區分NETs與單純壞死細胞釋放的DNA的關鍵。抗瓜氨酸化組蛋白H3（Cit-H3）抗體是目前最特異的標志物之一。高特異性的抗Cit-H3抗體（例如，經過精心驗證的兔單克隆抗體）能清晰地標記出發生瓜氨酸化的組蛋白，從而將真正的NETs結構與其它細胞外DNA區分開來。通常還會共標MPO或NE，以進一步確認。
  結果判讀：當Cit-H3陽性信號、MPO/NE陽性信號與DNA絲狀結構共定位時，即可確認為NETs。

2. 免疫組織化學技術：
對于石蠟包埋的臨床組織樣本（如動脈斑塊、血栓標本），IHC是研究NETs空間分布與疾病病理關聯的強大工具。同樣，使用抗Cit-H3抗體進行IHC染色，可以在復雜的組織微環境中特異性地定位NETs沉積的區域，并通過與血小板（CD41/CD61）、纖維蛋白等血栓成分的共定位分析，揭示其相互作用。

3. 酶聯免疫吸附測定：
對于液體樣本（如血漿、血清），定量檢測循環中的NETs衍生成分（稱為“NETomics"）具有無創、可動態監測的優勢。基于夾心法ELISA原理，使用捕獲抗體和檢測抗體對血漿中的游離Cit-H3、MPO-DNA復合物等進行定量。然而，血漿中NETs標志物的水平受多種因素影響，其標準化和解讀需格外謹慎。

技術挑戰與解決方案：
NETs檢測的主要挑戰在于其特異性。細胞死亡時會釋放DNA，但并非所有細胞外DNA都是NETs。因此，單純使用DNA染料或抗總組蛋白抗體會帶來高背景和假陽性。解決方案就是聯合使用多種標志物，其中Cit-H3是區分度的指標之一。選擇經過肽段競爭實驗驗證、且在PAD4敲除或抑制模型中信號消失的高質量抗Cit-H3抗體，是實驗成功的關鍵。

此外，使用細胞刺激陽性對照（如PMA刺激中性粒細胞）和陰性對照（如用DNase I處理降解NETs），以及設置抗體同種型對照，對于確保檢測的特異性至關重要。

總之，隨著對NETs在血栓性疾病中作用的認知不斷深入，對其精準檢測的需求日益迫切。以高特異性抗Cit-H3抗體為核心的免疫學檢測技術組合，為我們提供了在復雜生物樣本中窺探NETs的強大工具，不僅推動了基礎機制的探索，也為相關疾病的診斷和治療策略開發開辟了新的道路。