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A 液：主要成分是 BCA，還包含碳酸鈉、碳酸氫鈉、酒石酸鈉等緩沖物質(zhì)，以及氫氧化鈉調(diào)節(jié) pH 值，使溶液呈堿性環(huán)境，為雙縮脲反應和 BCA 顯色反應提供適宜條件 。其中，酒石酸鈉能夠穩(wěn)定 Cu2?，防止其在堿性條件下形成沉淀，保證反應的順利進行。
B 液：為硫酸銅溶液，提供反應所需的 Cu2? 。在使用時，需將 A 液和 B 液按照 50:1 的比例混合，配制成 BCA 工作液。混合后的工作液中，BCA 與 Cu2?形成 BCA - Cu2?復合物，該復合物與蛋白質(zhì)反應后生成紫色絡合物，用于后續(xù)的吸光度測定 。
蛋白質(zhì)標準品：通常為已知濃度的牛血清白蛋白（BSA）溶液，作為定量的參照標準。不同濃度的蛋白質(zhì)標準品用于繪制標準曲線，常見的標準品濃度梯度包括 0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL 等，科研人員可根據(jù)實際需求進行選擇和稀釋 。
稀釋蛋白質(zhì)標準品：將蛋白質(zhì)標準品（如牛血清白蛋白）按照預設(shè)的濃度梯度進行稀釋，制備不同濃度的標準品溶液。例如，取一定體積的高濃度標準品，用稀釋緩沖液（如 PBS）依次稀釋，得到 0 μg/mL、200 μg/mL、400 μg/mL、600 μg/mL、800 μg/mL、1000 μg/mL 等濃度的標準品 。
加樣與反應：在 96 孔板或比色皿中，分別加入不同濃度的標準品溶液（一般每孔或每份 20 μL），同時設(shè)置空白對照（加入等量的稀釋緩沖液替代樣本） 。隨后，向各孔或比色皿中加入 200 μL BCA 工作液，輕輕振蕩混勻，使溶液充分接觸 。將 96 孔板置于 37℃恒溫箱中孵育 30 分鐘，或在室溫下孵育 2 小時，使顯色反應。
吸光度測定：使用分光光度計，在 562 nm 波長處測定各標準品溶液和空白對照的吸光度值 。以標準品的蛋白質(zhì)濃度為橫坐標，吸光度值為縱坐標，繪制標準曲線。通常采用最小二乘法進行線性擬合，得到標準曲線的方程（y = ax + b，其中 y 為吸光度值，x 為蛋白質(zhì)濃度，a 為斜率，b 為截距） 。
樣本準備：根據(jù)樣本類型和蛋白質(zhì)濃度預估，對樣本進行適當稀釋。對于未知濃度的樣本，可先進行預實驗，選擇合適的稀釋倍數(shù)，確保樣本的吸光度值在標準曲線的線性范圍內(nèi) 。例如，對于細胞裂解液樣本，可先進行 10 倍稀釋，若吸光度值過高，再進一步稀釋。
加樣與反應：在 96 孔板或比色皿中加入 20 μL 稀釋后的樣本溶液，按照與標準曲線繪制相同的操作步驟，加入 200 μL BCA 工作液，振蕩混勻后進行孵育，使樣本中的蛋白質(zhì)與 BCA 試劑充分反應顯色 。
計算蛋白質(zhì)濃度：測定樣本溶液在 562 nm 處的吸光度值，將其代入標準曲線方程，計算出樣本的蛋白質(zhì)濃度 。若樣本進行了稀釋，需乘以相應的稀釋倍數(shù)，得到原始樣本的蛋白質(zhì)濃度 。
試劑儲存與使用規(guī)范：嚴格按照產(chǎn)品說明書儲存 BCA 試劑，A 液和 B 液應避光保存，防止 BCA 和 Cu2?發(fā)生氧化等反應而失效 。使用前將試劑平衡至室溫，BCA 工作液需現(xiàn)用現(xiàn)配，避免因放置時間過長導致顯色性能下降 。在加樣過程中，使用移液器準確吸取試劑和樣本，避免因加樣誤差影響定量結(jié)果。
樣本處理細節(jié)：確保樣本充分裂解或勻漿，使蛋白質(zhì)釋放到溶液中，避免因蛋白質(zhì)溶解導致定量結(jié)果偏低 。對于含有干擾物質(zhì)（如高濃度去污劑、還原劑）的樣本，需進行適當?shù)念A處理，如透析、超濾等方法去除干擾物質(zhì)，或優(yōu)化反應條件（如增加 BCA 工作液用量、延長孵育時間） 。
實驗條件控制：孵育溫度和時間對顯色反應有顯著影響，需嚴格按照說明書要求進行操作 。在使用 96 孔板進行實驗時，確保孔內(nèi)液體分布均勻，避免因邊緣效應導致吸光度值偏差 。每次實驗均需重新繪制標準曲線，以消除實驗誤差，保證定量結(jié)果的準確性 。
儀器校準與維護：使用分光光度計前，需進行儀器校準，確保波長準確性和吸光度測量精度 。定期對儀器進行維護和清潔，避免因儀器故障或污染影響實驗結(jié)果 。
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